細(xì)胞凍存是細(xì)胞生存的重要要領(lǐng)之一。使用凍存技能將細(xì)胞置于-196~C液氮中低溫生存，可以使細(xì)胞臨時(shí)離開(kāi)生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性生存起來(lái)，如許在必要的時(shí)間再蘇醒細(xì)胞用于實(shí)行。并且適度地生存肯定量的細(xì)胞，可以防備因正在造就的細(xì)胞被污染或其他不測(cè)變亂而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外，還可以使用細(xì)胞凍存的情勢(shì)來(lái)購(gòu)置、寄贈(zèng)、互換和運(yùn)送某些細(xì)胞。 細(xì)胞凍存時(shí)向造就基中參加掩護(hù)劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點(diǎn)低落，加之在遲鈍凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，淘汰了冰晶形成，從而制止細(xì)胞毀傷。尺度冷凍速率開(kāi)始為-1 到 -2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加快，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。

現(xiàn)在常用的掩護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油，它們對(duì)細(xì)胞**性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

實(shí)行質(zhì)料

儀器：液氮罐、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機(jī)等

試劑：0.25%胰酶、造就基、含掩護(hù)劑的造就基(即凍存液)

附：凍存液配制：造就基參加甘油或DSMO，使其終濃度達(dá)5-20%。掩護(hù)劑的種類(lèi)和用量視差別細(xì)胞而差別。配好后4℃下生存。

實(shí)行步調(diào)

1.消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液網(wǎng)絡(luò)至離心管中。

2.1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

3.沉淀加含掩護(hù)液的造就，計(jì)數(shù)，調(diào)解至5106/ml左右。

4.將懸液分至凍存管中，每管1ml。

5.將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口肯定要嚴(yán)，不然蘇醒時(shí)易出現(xiàn)爆裂。

6.貼上標(biāo)簽，寫(xiě)明細(xì)胞種類(lèi)，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。

7.按下列次序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時(shí))→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。

細(xì)致：操縱時(shí)應(yīng)警惕，以免液氮凍傷。液氮定期查抄，隨時(shí)增補(bǔ)，絕對(duì)不克不及揮發(fā)潔凈，一樣通常30立升的液氮能用1～1.5月。

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